W 1529 r. dominikanin Pankracy Klemme wprowadził do świątyni nabożeństwa luterańskie. Do 1572 r. używana ona była symultanicznie. Nabożeństwa katolickie odprawiane były przy ołtarzu głównym, zaś protestanckie przy bocznym ołtarzu św. Mikołaja. W czasie bezkrólewia, po śmierci Zygmunta II Augusta, kościół całkowicie został przejęty przez protestantów.
Wyposażany on był w dalsze dzieła sztuki. Zwłaszcza w liczne renesansowe epitafia.

Do większych inwestycji we wnętrzu kościoła należy zaliczyć postawienie w latach 1583/86 wielkich organów Antoniusa Friese. Instrument ten posiadał 55 głosów i trzy klawiatury. Koszt tego wielkiego dzieła wyniósł 12270 ówczesnych marek, a organy przetrwały ponad 170 lat. Po nich postawione zostały w 1760 r. organy gdańskiego organomistrza Fryderyka Rudolfa Dalitza. Posiadały one 52 głosy i kosztowały 44 tys. guldenów.

Staraniem króla Jana III Sobieskiego i prymasa Andrzeja Olszowskiego, w latach 1678/81 wybudowano na terenie plebanii Mariackiej, tzw. Kaplicę Królewską. Twórcą projektu jest niderlandzki architekt Tylman z Gameren. Wszystkie dekoracje rzeżbiarskie są dłuta Andrzeja Schliitera, póżniejszego dekoratora zbrojowni w Berlinie, do której wykonał słynne głowy martwych wojowników. Był on również budowniczym berlińskiego zamku królewskiego i twórca pomnika Wielkiego Elektora, stojącego dziś przed pałacem w Berlinie-Charlottenburgu.

W tym czasie kościół Mariacki odgrywał dużą rolę w życiu kulturalnym miasta. Działali w nim wybitni organiści i kompozytorzy, których dzieła dziś odkrywane, reprezentują poziom europejski, np. Paul Siefert (1623/66), Henrich Doebel (1679/93) i inni. Występowała tu słynna Capella Gedanensis, której tradycja została na nowo wskrzeszona.

Świątynię Mariacką odwiedzały systematycznie tłumy ludzi z całego świata, wśród nich głowy koronowane: królowie polscy, wazowi e szwedzcy, car Piotr Wielki w marcu 1717 r., cesarz Napoleon Bonaparte, którego pupil baron Vivant Denon zrabował z Gdańska obraz Hansa Memlinga.

W latach 1762/64 zbudowano w kościele nową, wspaniałą ambonę. Wykonali ją stolarz Gottlib Lemm i wybitny gdański rzeżbiarz Jan Henryk MeiBner. Aż do rozbiorów Polski kościół podlegał patronatowi królewskiemu. Po rozbiorach, gdy Gdańsk został wcielony do Prus, rozpoczęto niestety częściową wyprzedaż dzieł sztuki sakralnej.

W ten sposób w 1842 r. sprzedano arcyksięciu Maksymilianowi, ówczesnemu wielkiemu mistrzowi Krzyżaków, gotycki ołtarz św. Antoniego, który do dziś znajduje się w kościele Krzyżaków w Wiedniu. Natomiast rzeżba Matki Boskiej z ołtarza głównego, sprzedana została hrabiemu Sierakowskiemu z Waplewa Wielkiego.

Dużym dziełem we wnętrzu kościoła były nowe organy, zbudowane w 1891 r. przez firmę Terleckiego z Elbląga. Miały one 56 głosów. W latach 1935/38 zastąpiono je nowym instrumentem, postawionym przez firmę Kemper z Lubeki. Posiadały one aż 120 głosów, a więc więcej niż organy oliwskie. Całkowicie spłonęły pod koniec II wojny światowej.